全國統一客服電話:400-808-7372 加入收藏
                        瀏覽全部產品分類
                        發布日期:2020/11/13 8:33:00
                        1. 接種細胞:用膠原酶消化細胞并計數(不建議用胰酶)。轉染前18-24小時進行細胞的鋪板,以便在轉染時,貼壁細胞的密度大約在80%左右。注:培養液中的血清和抗生素不影響轉染效率。

                         2. 準備 EZ Trans-DNA 復合物

                          (1)轉染前將所有試劑置于室溫10分鐘。下面,以轉染24孔板培養皿為例,說明轉染的具體方法(如果在別的培養器皿中進行轉染,各試劑建議使用量見表1.:

                          (2)將1 μg 質粒DNA稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養基,用移液槍吹吸3-4次。

                          (3)將3 μL EZ Trans轉染試劑稀釋到40 μL無血清的高糖DMEM培養基,用移液槍吹吸3-4次。

                           注:無血清的高糖DMEM培養基是稀釋液,不能使用含血清的培養基(包括Opti-MEM)進行DNA和EZ Trans轉染試劑的稀釋!因為EZ Trans-DNA轉染復合物的形成過程不能含有血清。

                          (4)將稀釋好的EZ Trans轉染試劑一次性全部加入到已稀釋好的質粒DNA中,立即用移液槍吹吸3-4次。

                           注:此混合的順序不能反向進行!

                          (5)室溫放置10-15分鐘,以形成EZ Trans-DNA復合物。

                        表1:不同培養體積對應的待轉DNA、EZ Trans、稀釋液用量

                        3. 轉染細胞

                        1. 將上述80 μL EZ Trans-DNA轉染復合物均勻滴入到含細胞的培養皿中。輕輕晃動培養皿或輕微渦旋,讓EZ Trans-DNA復合物分散均勻。
                        2. 在 CO2培養箱中 37℃下孵育細胞,轉染后12-18小時,去除含EZ Trans-DNA復合物的培養液。(若細胞形態欠佳,可在轉染3-5h后,添加1/2體積的包含30%血清的生長培養基,在轉染12-18小時后完全去除含EZ Trans-DNA復合物的培養液,用含血清和抗生素的新鮮培養液。)
                        3. 轉染后zui快7h即可檢測到轉入基因的表達,可根據需要在24-48小時內檢測轉染效率。

                            注:篩選穩定轉染細胞株,可在上述操作后(轉染細胞24小時后),將細胞傳代至新鮮的生長培養基中(將細胞稀釋10倍以上),在 CO2培養箱中 37℃孵育過夜。在有轉染抗性基因相匹配的藥物篩選條件下,約 1~2周可篩選到耐藥性克隆,在這期間需經常更換含篩選藥物的生長培養基。

                        運輸與保存方法

                           常溫運輸,4℃保存,保質期12個月。

                        使用注意事項

                           質粒質量:請務必使用高質量轉染級無內毒素質粒。通過260 nm光吸收測定DNA 濃度,260nm / 280nm比值確定 DNA 純度(比值應該在1.8~2.0的范圍之內)。如有可能,請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的完整性。

                              細胞條件:使用適當保存和經常傳代的健康細胞。確保培養基沒有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞,請在轉染前至少傳代兩次。建議使用GIBCO或者李記生物的胎牛血清培養細胞。

                        特別提醒

                        1. 對于某些類型的細胞如 HEK-293、HEK293T、NIH/3T3 和 COS 細胞,在轉染前兩天鋪板可顯著提高轉入基因的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板,可適當降低鋪板密度,以確保轉染時細胞的匯合度仍為70~80%。

                        2. 對于接觸抑制敏感的細胞,可適當降低鋪板密度。

                        3. 即使在有蛋白(如10%的血清)存在的情況下,DNA-PEI復合物仍能轉染細胞,但是DNA-PEI復合物必須在無蛋白存在的條件下形成。

                        4. 對大多數細胞來而言,每 1μg DNA 使用 3.0 μL EZ Trans試劑都能獲得較高轉染效率。使用者也可嘗試每 1 μg DNA使用 1~4μL體積線性PEI轉染試劑進行優化。

                        EZ Trans轉染液用于不同細胞轉染時用量參考(以96孔板為例)

                        來源:來寶網

                        上一篇:反玉米素與反玉米素核苷的battle
                        下一篇:沒有了
                        標準物質中心_北京譜析科技有限公司  版權所有_京ICP備17056642號
                        国产一区二区精品视频-日韩亚洲一区二区三区-日韩精品一区二区中文